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        《南京農業大學》 2016年
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        苦蕎蛋白的制備、生物活性鑒定及其在豬群中的應用

        李宗杰  
        【摘要】:蕎麥是一種糧藥兼用的農作物,富含多種營養成分,包括蛋白質、膳食纖維、黃酮類物質以及礦物元素等。苦蕎蛋白的氨基酸組成比較特別,其營養價值高于大豆、小麥、玉米等作物。已有研究發現蕎麥蛋白或多肽具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇等多種生理活性,因此在飼料添加劑方面有廣闊的應用前景。本研究成功提取了苦蕎蛋白,并對其體內、外生物活性和功能進行了探討,研究包括以下4個方面:1苦蕎蛋白的提取與分離純化采用硫酸銨鹽析法提取得到苦蕎蛋白粗提物,然后分別采用DEAE-Sepharose離子交換和Sephadex G-75凝膠過濾層析對苦蕎蛋白粗提物進行分離純化,SDS-PAGE法分別測定了苦蕎蛋白粗提物和分離峰的分子量。結果發現苦蕎蛋白粗提物中的蛋白分子量大小主要介于11KDa-60KDa之間,而活性峰的分子量為38KDa,將其命名為苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)。2苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)的結構特征研究分別采用Edman測序法和MALDI-TOF質譜法分析了苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)的一級結構,根據測序結果和Mascot蛋白質數據庫搜索結果發現其蛋白質前體共由393個氨基酸殘基組成,其中信號肽由22個氨基酸殘基組成,成熟肽由371個氛基酸殘基組成。該序列與苦蕎種子貯存蛋白13S球蛋白的α亞基的N末端氨基酸序列完全一致,說明WSBWP很可能就是苦蕎種子貯存蛋白13S球蛋白的酸性亞基。以籽粒莧種子貯存蛋白中的11S球蛋白為模板(同源性為43.65%),在SWISS-MODEL工作平臺上進行同源建模,構建了WSBWP的三維模型,與大豆11S球蛋白結構相似,因此WSBWP屬于大豆11S球蛋白超家族的一員。3苦蕎鹽溶性球蛋白(WSBWP)及其活性肽的體外活性研究采用體外研究方法分別檢測了苦蕎鹽溶性球蛋白和其酶解活性肽(Pep-1-4)的抗菌活性、膽酸鹽吸附活性、自由基清除能力和抑制腫瘤細胞增殖的活性。抗菌活性檢測發現樣品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用;體外膽酸鹽吸附活性研究表明WSBWP、多肽Pep-1和Pep-3對膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和脫氧膽酸鈉三種膽酸鹽都有一定的吸附能力,而WSBWP的膽酸鹽吸附能力不如多肽強;抗氧化活性研究檢測了樣品自由基(OH·)的清除能力,發現WSBWP、多肽Pep-1和Pep-3對OH·都有一定的清除能力;MTT法分別檢測了苦蕎活性肽對人乳腺癌MCF-7細胞、人胃癌MGC80-3細胞和人結腸癌Caco-2細胞的增殖抑制活性,結果該活性肽對MCF-7細胞的增殖抑制作用比較明顯,其抑制效果強于對MGC80-3細胞和Caco-2細胞的抑制作用。4苦蕎蛋白在豬群中的應用研究初探1)苦蕎蛋白在斷奶仔豬生產中的應用研究初探在斷奶仔豬基礎日糧中添加苦蕎蛋白后,發現斷奶仔豬平均日增重比對照組增加了36.84%,料重比下降了33.33%,腹瀉率下降了41.6%,說明食用苦蕎蛋白提高了斷奶仔豬的生長性能和抗病力。血液生化分析發現實驗組仔豬血液中的總膽固醇(TC)水平降低了16.75%,而甘油三酯(TG)水平降低了39.73%,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平明顯增加,而且HDL-C與LDL-C的比率增加了32.94%;仔豬血清中的谷丙轉氨酶(GPT)水平比對照組高出32.64%,而谷草轉氨酶(GOT)水平比對照組高出28.07%,堿性磷酸酶(AKP)水平比對照組略有升高。通過測胃液pH發現苦蕎蛋白組的仔豬胃液pH由4.28降至3.69。同時,苦蕎蛋白組的仔豬胃的相對重量比對照組增加了20.44%,肝臟相對重量比對照組減少了19.31%。通過Miseq高通量測序得到了斷奶仔豬糞便樣品的微生物組成多樣性,在門水平分析發現樣品中的優勢菌主要是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)。在屬水平分析發現,仔豬食用苦蕎蛋白后,腸道中的乳酸菌(Lactobacillus)、瘤胃菌(Ruminococcus)和經粘液真桿菌(Blautia)的含量明顯增加;但一些致病菌如普雷沃菌(Prevotella)、鏈球菌(Streptococcus)的含量明顯下降。結果認為,飼料中給仔豬添加苦蕎蛋白后可提高斷奶仔豬平均日增重、降低料重比,且可改善胃酸分泌,明顯降低腹瀉率。此外,實驗組仔豬的膽固醇、甘油三酯等血液生化指標優于對照組,腸道菌群組成也發生了明顯的改善。2)苦蕎蛋白在育肥豬生產中的推廣應用苦蕎蛋白在斷奶仔豬取得較好的試驗效果后,采用80頭體重在80-90 kg的長白豬、大白豬和太湖黑豬(長×大×太)三元雜交的育肥豬為研究對象進行了推廣試驗。試驗過程將育肥豬隨機分兩組,對照組和實驗組各40頭豬,試驗組日糧中添加5%蕎麥蛋白,對照組添加等量的大豆蛋白,飼喂時間持續一個月,每天觀察豬只生長狀態并記錄。試驗開始和試驗結束前分別將育肥豬空腹12小時,逐頭稱體重。平時記錄采食量并結算飼料消耗情況,計算平均日增重(ADG)、料重比(F/G)以及出欄率。在育肥豬的推廣實驗表明,實驗組育肥豬的平均日增重比對照組增加了22.22%,與對照組相比料重比下降了14.29%(p0.05),提示育肥豬基礎日糧添加苦蕎蛋白后能夠促進育肥豬生長,提高飼料轉化率。
        【學位授予單位】:南京農業大學
        【學位級別】:博士
        【學位授予年份】:2016
        【分類號】:S828.5

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