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        《遵義醫科大學》 2019年
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        透明質酸聯合人羊膜上皮細胞對人外周血單個核細胞及移植治療1型糖尿病大鼠的免疫調節作用

        程亞偉  
        【摘要】:目的:探討透明質酸(hyaluronic acid,HA)聯合人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)對異基因T淋巴細胞的調節作用,進而通過胰腺包膜原位移植,研究HA聯合hAECs移植治療1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)大鼠的療效及免疫調節作用。方法:采用酶消化法分離hAECs,然后用免疫組織化學染色法和流式細胞術(flow cytometry,FCM)進行表型鑒定。運用Ficoll-hypaque密度梯度離心法分離正常人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。共培養細胞比例篩選實驗,依據PBMCs與hAECs細胞數的比例,分為2:1、10:1和50:1共3組,對照組為PBMCs,各組用10μg/mL植物凝集素(PHA-P)刺激后,培養72 h,RT-qPCR檢測Foxp3的轉錄水平;96 h后MTT法檢測各組OD值,篩選hAECs與PBMCs的最優細胞數比例。HA作用濃度篩選實驗,分為PBMCs、不同濃度HA+PBMCs、hAECs+PBMCs(hAECs:PBMCs=1:2)、不同濃度HA+hAECs+PBMCs,共10組,其中HA的相對分子質量為300 KD,濃度分別為0.001,0.01,0.1和1 mg/mL。培養72 h后,RT-qPCR檢測Foxp3的轉錄水平;96 h后通過MTT法檢測各組OD值,篩選最佳HA濃度。聯合治療對PBMCs中T細胞亞群的影響實驗,分為PBMCs、HA+PBMCs、hAECs+PBMCs、HA+hAECs+PBMCs等4組,其中HA濃度為0.1 mg/L。培養72 h后,FCM檢測T細胞中Th1、Th2、Tc1、Tc2、Th17和Treg等亞群的比例。體內實驗,通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,30 mg/Kg,連續4天)構建T1DM模型大鼠,造模成功后隨機分為5組(n=6):模型組、胰島素治療組(腹腔注射3 U精蛋白鋅胰島素,biw)、HA組(0.1 mg/L)、hAECs組(2×10~6細胞/只)、HA+hAECs組,采用胰腺包膜下原位移植治療,并設置正常對照組(n=6)。每周尾靜脈取血測血糖。治療30 d后,腹主靜脈取血,FCM檢測靜脈血T淋巴細胞亞群比例。病理組織采用HE染色、免疫組織化學染色評價胰島組織結構和功能。ELISA檢測血清C肽,以及IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17和TGF-β1等細胞因子的含量。結果:分離培養的P2 hAECs高表達CD29、CD166、CD73,低表達CD44,不表達造血干細胞標志物CD45、CD34和MHC-II類分子HLA-DR,高表達上皮細胞標志物CK19,不表達間充質細胞標志物波形蛋白。MTT檢測結果提示,hAECs呈劑量依賴性抑制PHA-P刺激的異基因PBMCs增殖,當PBMCs:hAECs為2:1時,增殖抑制率達到最大(32.67±3.918)%。在共培養體系中,加入0.001,0.01和0.1 mg/mL劑量的HA能明顯促進hAECs抑制PBMCs增殖(P0.05),抑制率分別為(40.91±4.387)%、(46.58±2.785)%、(40.24±5.671)%,但1 mg/mL HA無明顯的促進效應,另單獨使用HA對PBMCs的增殖無影響。進一步研究提示,hAECs能促進PHA-P刺激的異基因PBMCs表達Foxp3。而且,在HA濃度為0.01,0.1 mg/mL時,能協同hAECs促進PBMCs表達Foxp3(P0.01)。在0.001和1 mg/mL劑量時,HA無明顯協同效應,單用HA對PBMCs的Foxp3基因表達亦無明顯影響。FCM檢測T淋巴細胞亞群結果提示,與PBMCs組相比,hAECs能降低T淋巴細胞中Tc1亞群(P0.05),對Treg,Th17,Th1,Th2,Tc2亞群無明顯影響;單用HA對PBMCs的亞群無明顯影響。與PBMCs組和HA+PBMCs組相比,HA聯合hAECs能降低Th1,Tc1亞群比例,但對Treg,Th17,Th2,Tc2亞群比例無明顯影響。體內實驗結果提示:治療30 d后,與模型組相比,胰島素治療組大鼠血糖水平無明顯變化,hAECs治療組和HA+hAECs治療組T1DM大鼠血糖水平均明顯降低(P0.01),HA組無明顯治療效果。與胰島素治療組相比,hAECs治療組和HA+hAECs治療組T1DM大鼠血糖水平均明顯降低(P0.05或P0.01)。進一步檢測大鼠血清中C肽含量,結果與大鼠血糖水平對應。胰腺病理切片HE染色和熒光染色顯示,與模型組相比,hAECs和HA+hAECs治療組的鏡下胰島數量較多,體積較大,胰島中胰島素陽性細胞數量明顯較多,可觀察到有少數hAECs歸巢至胰島部位并部分分化為胰島素陽性細胞。T細胞亞群及免疫相關細胞因子分析結果進一步提示,hAECs治療能明顯改善Th17/Treg比值,而且HA與hAECs聯合治療能更顯著增強hAECs對Th17/Treg的調節能力。結論:HA能增強hAECs對PHA-P刺激的異基因人PBMCs增殖的抑制效果,以及對T淋巴細胞亞群的調節能力;在體內,HA能增強hAECs對STZ誘導的T1DM大鼠療效,其機制可能和逆轉T1DM大鼠Th17/Treg比值,恢復機體免疫平衡,減少對胰島β細胞損傷有關。
        【學位授予單位】:遵義醫科大學
        【學位級別】:碩士
        【學位授予年份】:2019
        【分類號】:R587.1

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