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        《遵義醫科大學》 2019年
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        基于基因組信息的深海放線菌Streptomyces koyangensis SCSIO 5802中次級代謝產物的挖掘

        涂佳佳  
        【摘要】:目的:Streptomyces koyangensis SCSIO 5802是分離自南海底泥沉積物的一株放線菌,研究發現在常規實驗室條件下發酵分離得到的化合物不僅對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)具有較強的抑制活性,還具有細胞毒性。本論文以S.koyangensis SCSIO 5802為研究對象,利用基因敲除、基因激活、培養條件優化等方法進一步挖掘該菌株生產次級代謝產物的潛力。方法:首先,采用Illumina Miseq結合第三代測序技術對S.koyangensis SCSIO5802菌株的基因組測序,得到該菌株的完成圖,利用生物信息學方法分析S.koyangensis SCSIO 5802全基因組序列,并使用antiSMASH在線軟件進行基因注釋(http://antismash.secondarymetabolites.org/);第二,利用PCR-targeting的方法對負責abyssomicin類和candicidin類化合物的生物合成的聚酮合酶基因abmB1和canD進行同框缺失,獲得基因工程菌株S.koyangensis SCSIO 5802AC;第三,利用發酵優化的手段對S.koyangensis SCSIO 5802AC菌株的次級代謝產物進行挖掘;最后,在S.koyangensis SCSIO 5802AC工程菌株的基礎上進一步激活5802基因組中沉默生物合成基因簇。結果:1.通過對S.koyangensis SCSIO 5802的全基因組進行掃描測序,結果顯示S.koyangensis SCSIO 5802基因組長約6.86 Mb,GC含量為73.4%,含有6419個編碼基因,75個tRNA和3119個rRNA,利用在線生物信息學軟件antiSMASH分析,基因組上共含有21個生物合成基因簇。2.利用基因敲除的方法對abyssomicins/neoabyssomicins類化合物的生物合成聚酮合酶基因abmB1進行同框缺失突變,得到雙交換突變株SCSIO 5802A,從而激活了candicidin類化合物的產生。通過生物信息學方法鑒定了candicidin類化合物的生物合成基因簇,推導了其可能的生物合成途徑;在此基礎上,以基因突變株SCSIO 5802A為出發菌株,對candicidin化合物的聚酮合酶基因canD再次進行同框缺失突變,最終得到了既不生產abyssomicins/neoabyssomicins類化合物也不生產candicidin類化合物的背景干凈、代謝流清晰的突變株S.koyangensis SCSIO 5802AC,該菌株用于后續次級代謝產物的挖掘。3.采用11種培養基對S.koyangensis SCSIO 5802AC菌株進行發酵優化,通過對發酵結果進行HPLC分析,其中R5培養基、Hmt培養基、P2培養基和A1培養基在19 min左右出現一個新峰,該化合物在500 nm處有最大紫外吸收。4.以遺傳背景干凈、代謝流清晰的菌株S.koyangensis SCSIO 5802AC為基礎菌株。利用PCR-targeting技術和屬間接合轉移技術,成功實現了紅霉素強啟動子在6個基因簇的結構基因或者調控基因前的添加。突變株發酵結果經HPLC-DAD分析,發現激活了可能編碼herboxidiene類化合物的表達。結論:通過基因敲除、培養基優化、基因簇骨架基因前強啟動子的添加可以有效挖掘S.koyangensis SCSIO 5802菌株中產生的次級代謝產物。
        【學位授予單位】:遵義醫科大學
        【學位級別】:碩士
        【學位授予年份】:2019
        【分類號】:R915

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