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        《昆明理工大學》 2018年
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        苦蕎抗菌肽的制備、應用及抑菌機理的研究

        王鳳萍  
        【摘要】:苦蕎是我國特有、藥食兼備的糧食作物,營養成分全面,蛋白含量豐富,具有極高的研究價值。抗菌肽是肽類抗菌物質的統稱,其分子量小、溶解性好、抑菌譜廣且活性強、具有良好的選擇性、不容易產生耐藥性,可作為傳統的化學防腐劑的替代物,應用于食品工業中。本研究以苦蕎為原材料,選用醬油曲霉對其進行固態發酵,制備具有抗菌活性的肽類物質,優化發酵工藝、應用于牛肉保鮮、對苦蕎抗菌肽進行分離純化并研究其抑菌活性、溶血性及抑菌機理。主要研究內容和結果如下:1、采用醬油曲霉對苦蕎進行固態發酵,以肽濃度、抑菌率為指標,在單因素的基礎上,采用Box-Behnken實驗優化其發酵工藝。最佳工藝為:接種量為2.47 mL,發酵時間為39.84h,葡萄糖添加量為0.98%,加水量為6.04 mL,粗提物的肽濃度預測值為29.12 mg/mL。在最優條件下進行驗證實驗,苦蕎抗菌肽溶液的肽濃度為30.64 mg/mL,比優化前(27.99mg/mL)提高了9.47%,對金黃色葡萄球菌的抑菌率為94.44%,比優化前(87.81%)提高了7.55%,對大腸桿菌的抑菌率為19.09%,比優化前(10.17%)提高了87.71%。3、不同濃度的苦蕎抗菌肽粗提物溶液(5、10和25 mg/mL)涂膜保鮮牛肉,Nisin作為陽性對照,4℃條件下儲藏,以牛肉的感官評價、揮發性鹽基氮(TVB-N)、硫代巴比妥酸(TBA)、表面顏色、質構及菌落總數作為評價指標。結果表明:對照組在儲存6天時,感官評價分值低于4分,而10 mg/mL Nisin和5 mg/mL苦蕎抗菌肽、10 mg/mL和25 mg/mL苦蕎抗菌肽的感官評價分值分別在第9 d和12 d后低于4分;10 mg/mL和25 mg/mL苦蕎抗菌肽處理組的TVB-N值在整個貯藏期間均未超標(15 mg/100 g),對照組和5 mg/mL苦蕎抗菌肽處理組的TVB-N值超標時間分別為12 d和15 d;10 mg/mL苦蕎抗菌肽處理組的效果顯著優于10 mg/mL Nisin處理組;對照組在第12 d時,菌落總數超過了6.0 lg(cfu/g),屬于腐敗變質肉。在整個存儲期間,各個處理組的菌落總數均未超過6.0 lg(cfu/g)。綜合感官評價、TVB-N的結果,對照組的牛肉塊保鮮期為3 d,10 mg/mL Nisin和5 mg/m L苦蕎抗菌肽處理組的保鮮期為6 d,10 mg/mL和25 mg/mL苦蕎抗菌肽處理組的保鮮期是9 d。3、最佳發酵條件下的苦蕎抗菌肽粗提物溶液,超濾收集5 kDa的肽段,經葡聚糖凝膠SephadexG-25進一步分離純化后,對活性高的洗脫峰用shot-gun質譜檢測法測序,篩選得到3條高活性抗菌肽序列分別為:肽1(QPEDPR)、肽2(KETHDHP)、肽3(KILISGIIRG)。4、根據3條抗菌肽序列,化學合成的3條抗菌肽,分別研究其抑菌活性、溶血性及其抑菌機理。結果表明,肽1對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、宋內志賀氏菌、單核李斯特菌和腸炎沙門菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為15.625?g/mL、250?g/mL、31.25?g/mL、125?g/mL和125?g/mL,肽2為15.625?g/mL、62.5?g/mL、62.5?g/mL、125?g/mL和62.5?g/mL,肽3為15.625?g/mL、15.625?g/m L、15.625?g/mL、31.25?g/mL和62.5?g/mL。肽1和肽2對白色念珠菌的MIC為3.9?g/mL;肽1、肽2和肽3在高溶度下(500?g/mL)的溶血率分別為1.49%、1.79%和1.31%;通過β-半乳糖苷酶誘導、鈣黃綠素泄露、細胞膜完整性和K~+泄露和凝膠阻滯實驗,研究抗菌肽的抑菌機制。β-半乳糖苷酶誘導實驗結果表明苦蕎抗菌肽對大腸桿菌的膜擾亂(190 min時OD_(420)范圍為0.0061~0.011)強于金黃色葡萄球菌(190 min時OD_(420)范圍為0.0024~0.0031);鈣黃綠素泄露實驗中,肽3對金黃色葡萄球菌鈣黃綠素的釋放最高(78.5%);肽3與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA能夠完全結合(肽與DNA的質量比分別為50和30),DNA完全阻滯在點樣孔。
        【學位授予單位】:昆明理工大學
        【學位級別】:碩士
        【學位授予年份】:2018
        【分類號】:TS202.3

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